一、勻漿介質(zhì)
一般采用0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶可根據(jù)樣本及測定指標的情況自行設定濃度,目的是保持樣本的等滲環(huán)境。
二、組織勻漿的制備
1、取組織塊(0.2g~0.5g)zui少可到5~10mg在冰冷的PBS中漂洗,濾紙拭干,準確稱重,放入5ml的勻漿管中。
2、按重量(g):體積(ml)=1:4的比例加入4倍體積的勻漿介質(zhì)于勻漿管中,冰水浴條件下,用眼科小剪盡快剪碎組織塊。
3、勻漿的方式:手工勻漿,機器勻漿。
① 手工勻漿:左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手將搗桿垂直插入套管中,上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次(6~8分鐘),充分研碎,制成20%的勻漿液。
② 機器勻漿:用組織搗碎機10000~15000 轉(zhuǎn)/分 上下研磨制成20%組織勻漿,也可用內(nèi)切式組織勻漿機制備(勻漿時間10秒/次,間隙30秒,連續(xù)3~5次,在冰水中進行,可適當延長勻漿時間),
鏡檢觀察:取少量組織勻漿作涂片(直接涂片、染色均可以),顯微鏡下觀察細胞是否破碎,若沒有則可延長勻漿時間。
4、將制備好的20%勻漿液用普通離心機或低溫低速離心機4000轉(zhuǎn)/分左右,離心10~15分鐘,取上清液進行測定.
三、樣本保存:
植物組織樣本暫時不測定,可立即低溫凍存,溫度越低越好,中間如*凍融,-20℃以下可保存三個月,-70℃以下可保存六個月。
制備好的勻漿液建議不要凍存,當天進行測定,如放置時間過長相關酶活會有所下降,部分指標4℃可存放3~5天(如SOD要存放2~3天,MDA可存放3~5,總蛋白測定可存5~7天等)