(一)試劑及配制
1.飽和硫 酸銨液
2.各種磷酸鹽緩沖液
⑴ 0.2mol/L原液
A液:0.20Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4·H2O 31.20g
H2O 1 000ml
B液:0.20Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O 71.7g
H2O 1 000ml
⑵ 0.10Mol/L pH8.0PB液
A液: 53ml
B液: 947ml
H2O 加至 2 000ml
⑶ 0.005Mol/L pH8.0 PB液
取0.10Mol/L pH8.0 PB液100ml,加H2O至2 000ml
⑷0.025 Mol/L pH8.0 PB液
取0.10Mol/L pH8.0 PB液500ml,加水至2 000ml。
⑸ 0.035 Mol/L pH8.0 PB液
取0.10.1 Mol/L pH8.0 PB液700ml,加水至2 000ml。
⑹ 0.10Mol/L pH5.8PB液
A: 920ml
B: 80ml
H2O 加至 2 000ml
⑺ 0.40Mol/L pH5.2pB液
a液.0.40Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4·2H2O 62.40g
H2O 加至 1 000ml
B液.0.40Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O 143.4g
H2O 加至 1 000ml
取a液 960ml
b液 40ml
混合即可。
⑻ 0.01 Mol/L pH8.0PBS液
取0.10Mol/L pH8.0 PB液 100ml
NaCl 8.20g
H2O 加至 1 000ml
3.DEAE-纖維素(細(xì)粒級)
4.SephadexG200
(二)操作方法
1.取一定量的血清,加等量的生理鹽水,然后逐漸滴加飽和硫 酸銨溶液,使成40%的飽和度,靜置30min。
2.10 000r/min離心10min,去上清。
3.加入一定量的生理鹽水,使沉淀溶解,再加入飽和硫 酸銨溶液,使成40%飽和度。10 000r/min離心10min,去上清。
4.再重復(fù)步驟3一次。
5.將沉淀以少量生理鹽水溶解,透析,除鹽濃縮。
6.制備DEAE-纖維素柱,以0.005Mol/L pH8.0PB液平衡。
同時制備SephadexG200凝膠柱,以0.01Mol/L pH8.0PBS液平衡并進行洗脫。
7.以0.005Mol/L pH8.0PB液洗脫,得蛋白液為IgG。
7. 以0.025 Mol/L pH8.0PB液洗脫,得蛋白主要是IgE,再過SephadexG200凝膠柱,收集*峰即為純IgE。
8. 以0.035 Mol/L pH8.0PB液洗脫,得蛋白主要是IgA,再過SephadexG200凝膠柱,收集*峰即為純IgA。
10.以0.10Mol/L pH5.8PB液洗脫,洗脫液主要有IgM、IgG及白蛋白的混雜物。
11.以0.40Mol/L pH5.2PB液洗脫,得蛋白液主要是IgM。過SephadexG200,收集第二峰即為純IgM。