緩沖液
免疫細胞化學中應用的緩沖液種類較多,即使是同種緩沖液,其濃度、pH、離子強度等也常不同。在此介紹幾種zui常用緩沖液的配制。
1、0.2mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer,PB)
試劑: NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O。
配制方法:配制時,常先配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4,兩者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液(PB),根據(jù)需要可配制不同濃度的PB和PBS。
(1)0.2mol/L的NaH2PO4;稱取NaH2PO4·2H2O 31.2 g 或NaH2PO4·H2O 27.6g加重蒸水至1000ml溶解。
(2)0.2mol/L的Na2HPO4:稱取Na2HPO4·12H2O 71.632g(或Na2HPO4·7H2O 53.6g或Na2HPO4·2H2O 35.6g)加重蒸水至1000ml溶解。
(3)0.2mol/L pH7.4的PB的配制:取19ml 0.2mol/L的NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的Na2HPO4·12H2O,充分混合即為0.2mol/L的PB(pH約為7.4~7.5)。若pH偏高或偏低,可通過改變二者的比例來加以調整,室溫保存即可。
2、0.01mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水(Phosphate Buffered Saline, PBS)
試劑:0.2 mol/L PB 50ml
NaCl 8.5~9g(約0.15mol/L)
重蒸水 至1000ml
配制方法:稱取NaCl8.5~9g及0.2mol/L的PB50ml,加入1000ml的容量瓶中,zui后加重蒸水至1000ml,充分搖勻即可。若擬配制0.02mol/L的PBS,則PB量加倍即可,依此類推。
PB和PBS是免疫細胞化學實驗中zui為常用的緩沖液,0.01mol/L的PBS主要用于漂洗組織標本、稀釋血清等,其pH應在7.25~7.35之間,否則需要調整。0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。一般情況下,0.2mol/L PB的pH值稍高些,稀釋成0.01mol/L的PBS時,常可達到要求的pH值,若需調整pH,通常也是調PB的pH。
3、Karasson–Schwlt's磷酸鹽緩沖液
試劑: NaH2PO4·H2O 3.31g
Na2HPO4·7H2O 33.77g
重蒸水 至1000ml
配制方法:同前。該緩沖液主要用于配制Zamboni's固定液。
4、0.5mol/L pH7.6的Tris- HCl緩沖液。
試劑:Tris(三羥甲基氨基甲烷) 60.57g
1 N HCl 約420ml
重蒸水 至1000ml
配制方法:先以少量重蒸水(300~500ml)溶解Tris,加入HCl后,用1N的HCl或1N的NaOH將pH調至7.6,zui后加重蒸水至1000ml。此液為儲備液,于4℃冰箱中保存。免疫細胞化學中常用的Tris-HCl緩沖液濃度為0.05mol/L,用時取儲備液稀釋10倍即可。
該液主要用于配制Tris緩沖生理鹽水(TBS)、DAB顯色液。
5、Tris緩沖生理鹽水(Tris Buffered Saline,TBS)
試劑:0.5mol/L Tris-HCl緩沖液 100ml
NaCl 3.5~9g(0.15mol/L)
重蒸水 至1000ml
配制:先以重蒸水少許溶解NaCl,再加Tris-HCl緩沖液,zui后加重蒸水至1000ml,充分搖勻使Tris終濃度為0.05mol/L。
TBS主要用于漂洗標本,常用于免疫酶技術中。
6、Tris-TBS(TBS)
試劑:Triton X-100 10ml(1%)或3ml(0.3%)
0.5mol/L Tris緩沖液(pH7.6) 1000ml(50ml)或(0.2mol/L的PB)
NaCl 8.5~9g
重蒸水 至1000ml
配制方法:先以重蒸水少許溶解NaCl后,加入Triton X-100及Tris緩沖液或(PB),zui后加重蒸水至1000ml,充分搖勻。
該液常用濃度為1%及0.3%,前者主要用于漂洗標本,后者主要用于稀釋血清。細胞
7、0.1mol/L(pH7.4)二甲胂酸緩沖液
試劑:0.2mol/L二甲胂酸鈉 500ml
0.1N HCl 28ml
蒸餾水 至1000ml
配制方法:先稱取二甲胂酸鈉(MW:214)42.8g,加蒸餾水至1000ml,使0.2mol/L的二甲胂酸鈉溶液;再取HCl1.7ml加蒸餾水至1000ml,配成0.1N,zui后取0.2mol/L二甲胂酸鈉溶液500ml及0.1N HCl28ml混合,加蒸餾水至1000ml,即為0.1mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液。